Мощността и удобството на съвременните програми за текстообработка, като Microsoft Word, направиха революция в ежедневните ни задачи. Трябва да създадете бърза автобиография за нова възможност за работа? Отлагате ли последната курсова работа, която трябва да бъде утре? Дори създаване на бърз списък с хранителни стоки - Повечето от нас разчитат на програми за текстообработка като настойници на нашия писмен живот. Функционалността е впечатляваща и за разлика от своя архаичен предшественик, пишещият текст, само с няколко натискания на клавиши могат да променят, изтриват или добавят думи, както желае потребителят.
От години изследователите търсят начини да имитират тези способности, но в генетичен мащаб, за да променят точно и ефективно генетичната информация. Разработването на "Microsoft Word of DNA" би позволило на учените да проучат по-добре функционирането на отделните гени и мутациите, които допринасят за генетични нарушения. С едно-единствено откритие, наречено CRISPR-Cas9, учените бяха завинаги подобрени от ДНК пишещи машини до ДНК текстов процесор; редактиране на гени със същата лекота, прецизност и гъвкавост. Технологията е придобила огромно сцепление и популярност поради своята гъвкавост и адаптивност.
Макар и мощен, CRISPR далеч не е перфектна техника и като всяка друга има своите недостатъци и ограничения. Едно от основните му приложения включва прецизно насочване и мутация на ген, който представлява интерес, така че той вече да не функционира в рамките на определен тип клетка. Когато генът се направи нефункционален, всякакви характерни промени в клетката (известни като фенотипове) могат да бъдат изследвани, за да се получи по-добра представа за това какво прави този конкретен ген. Но начинът, по който CRISPR мутира отделни гени, може да представлява предизвикателство за изследователите. Когато се постави в клетка, системата CRISPR-Cas9 прецизно мутира целевия ген, като отрязва ДНК на клетката. След това клетката възстановява счупената си ДНК предимно чрез процес, наречен нехомоложно крайно свързване (NHEJ). Но този процес на възстановяване е податлив на грешки и може да причини променливост в ремонтираната ДНК; често води до замествания, изтривания или допълнения към генетичния код. Допълнително към предизвикателството е, че ефективността на CRISPR може да варира, като действа така, че да направи и двете копия на целевия ген нефункционални или понякога само едното. Тези неизвестни промени в ДНК, причинени от CRISPR, могат да направят изключително трудно за учените да интерпретират основната генетична причина за наблюдаван фенотип; прави инструмента далеч по-малко полезен.
В скорошна публикация в Cell Reports, лабораторията Taniguchi в Института по невронауки Макс Планк във Флорида (MPFI) разработи нова методология, която позволява свързването на фенотипа с генотипа. Иновативно комбинирайки авангардна техника на лазерна микродисекция с генотипиране на единични клетки, лабораторията Taniguchi е проектирала експериментален тръбопровод, способен да изучава медиираните от CRISPR ефекти в клетките, като същевременно установява точно точните промени в ДНК, които са ги причинили. Този нов протокол ще отвори нови пътища за изучаване на невробиологията и ще надгради допълнително вече мощните способности на CRISPR.
„Въпреки че CRISPR е точно насочен към ген, който представлява интерес, поради NHEJ, неговите ефекти могат да бъдат силно променливи,“обяснява д-р Андре Щайнеке, научен сътрудник и първи автор на публикацията. "CRISPR може да остави клетки с напълно нефункционални гени, отслабени гени или понякога дори да подобри тяхната функция. Това не е такъв проблем, когато премахвате такъв, който причинява много забележим ефект в клетките, защото можете лесно да визуализирате промяната и отсъствието на протеина Но някои, особено гените в мозъка, нямат поразително очевидни ефекти или са много трудни за визуализиране. Нашата цел беше да създадем широко приложима стратегия, способна надеждно да определи точната генетична причина и да я свърже с наблюдавания фенотип."
За да потвърди стратегията си, екипът на MPFI проектира CRISPR технология за насочване към ген в пирамидални неврони, кодиращи критичен структурен протеин, наречен Ankyrin-G (AnkG). Обикновено протеинът AnkG е ограничен до специализиран регион на неврона, известен като начален сегмент на аксона (AIS), който е отговорен за генерирането на потенциали за действие. Когато AnkG се отстрани, AIS претърпява забележимо удебеляване, което може да бъде открито с помощта на микроскопия. С тази характерна особеност невроните, които нямат AnkG, могат лесно да бъдат разграничени и точният им генотип може да бъде потвърден. Те открили, че предимно невроните, трансфектирани с тяхната CRISPR сонда, показват загуба на AnkG, както и значително удебелен AIS. Но малка част от невроните, трансфектирани с CRISPR, все още показват нива на AnkG и дебелина на AIS, сравними с див тип неврони; демонстриране на различните ефекти на CRISPR върху различни клетки. За да проучи и потвърди основните генетични причини, екипът използва лазерна микродисекция, за да изолира и извлече отделни неврони, чийто фенотип вече е бил характеризиран. Веднъж извлечен, екипът секвенира всяка отделна клетка поотделно, за да определи генотипа. Те открили, че тяхната стратегия може надеждно и възпроизводимо да свърже наблюдавания фенотип с генотип, където невроните без AnkG с удебелени аксони показват мутации на загуба на функция и в двете копия на гена, докато невроните с нормални нива на AnkG показват мутации само в едно копие (неврони, трансфектирани с CRISPR) или нормални генотипове (контролни неврони). След това екипът потвърди стратегията си, използвайки два допълнителни гена, MeCP2 и Satb2, като установи, че техният процес може отново ефективно да корелира наблюдаваната характеристика с основната генетика.
"Насочването на гени, базирано на CRISPR/Cas9, има голямо обещание за систематично разбиране на молекулярната основа, лежаща в основата на сглобяването, функцията и дисфункцията на невронните вериги", отбелязва д-р Хироки Танигучи. D. „Перфектното съвпадение между генотипите, определени от нашето секвениране на единични клетки, и тези, изведени от оценката на фенотипа, предполага, че нашият подход е мощен нов метод, способен да подобри надеждността и да разшири приложенията на базираните на CRISPR техники.“
